Expression of Difficult Proteins: Challenges and Solutions
De nombreuses protéines sont notoirement difficiles à exprimer dans des systèmes hétérologues en raison de nombreux facteurs contributifs. Un problème courant survient lorsqu’un hôte étranger peine à plier correctement une protéine qu’il ne produit pas naturellement. Par exemple, exprimer une protéine d’un eucaryote supérieur dans un système bactérien peut être particulièrement difficile en raison de différences significatives dans des facteurs tels que l’utilisation des codons, les taux de traduction et les conditions rédox. De plus, les propriétés intrinsèques de la protéine cible peuvent poser des défis pour l’hôte.
Par exemple, les protéines avec plusieurs domaines transmembranaires peuvent ne pas s’intégrer correctement dans les bicouches membranaires de l’hôte, ou la protéine peut ne pas être exprimée sous une forme soluble. De plus, de nombreuses protéines nécessitent des modifications post-traductionnelles, telles que la glycosylation ou la phosphorylation, qui peuvent être absentes ou varier considérablement selon les hôtes d’expression.
Il n’existe pas de solution universelle pour exprimer toutes les classes de protéines difficiles. Au lieu de cela, des stratégies spécifiques adaptées aux défis d’expression peuvent améliorer les chances de succès. Dans les systèmes d’expression microbienne, cela implique souvent l’utilisation de souches hôtes génétiquement modifiées conçues pour améliorer la production de certaines classes de protéines difficiles. D’autres approches se concentrent sur l’optimisation des aspects du processus de production de protéines.
Par exemple, certains hôtes d’expression permettent une régulation précise de l’expression des gènes cibles, tandis que des étiquettes protéiques spécifiques peuvent faciliter l’insertion correcte d’une protéine dans la membrane de l’hôte ou améliorer sa solubilité.
L’expression des protéines difficiles inclut ces domaines de focus :
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Expression de protéines à liaisons disulfure
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Expression de protéines membranaires
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Expression de protéines toxiques
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Insolubilité des protéines cibles
Défis dans l’expression des protéines recombinantes
Les protéines recombinantes de haute qualité sont des matériaux de départ essentiels pour des recherches réussies et des programmes de développement de médicaments. Les attributs de qualité clés des protéines recombinantes incluent la pureté, l’état oligomérique, la stabilité thermique et chimique, le pliage correct, les modifications post-traductionnelles (PTM) et l’activité biologique. Cependant, la complexité inhérente des protéines rend souvent leur expression et leur purification difficiles.
Certaines caractéristiques de séquence ou de structure, telles que les domaines transmembranaires ou les séquences d’ancrage GPI, peuvent avoir un impact significatif sur le rendement et la stabilité des protéines recombinantes. Par exemple, les protéines avec des domaines transmembranaires ont tendance à s’associer à la membrane plasmique, ce qui entraîne des rendements réduits.
De plus, la nature hydrophobe des régions transmembranaires peut compromettre la stabilité des protéines, nécessitant l’utilisation de détergents ou d’agents de stabilisation à base de lipides lors de la purification et de la formulation. La surexpression des protéines cibles peut également entraîner des changements physiologiques involontaires dans les cellules hôtes, conduisant à des protéines mal pliées ou à leur dégradation par les protéases de l’hôte.
Les protéines sont des molécules intrinsèquement délicates, sensibles aux stress environnementaux tout au long des processus d’expression et de purification. En conséquence, la production de protéines recombinantes nécessite une planification minutieuse et une optimisation des facteurs clés, y compris le choix du système hôte, les conditions de culture, la durée d’expression et les stratégies de purification, pour obtenir des rendements élevés tout en maintenant l’intégrité des attributs de qualité critiques.
En outre, les avancées dans les plateformes de criblage à haut débit d’anticorps et de protéines, en particulier les techniques basées sur l’affichage, ont permis la génération routinière de vastes bibliothèques de candidats anticorps et protéines thérapeutiques. Pour valider la fonctionnalité et l’efficacité de ces candidats principaux, des formes recombinantes doivent être produites. Cela nécessite le développement de plateformes d’expression de protéines robustes, polyvalentes et à haut débit pour soutenir les efforts de découverte de candidats. Cependant, cette demande croissante introduit de nouveaux défis dans le domaine de l’expression des protéines recombinantes, soulignant le besoin d’approches innovantes pour rationaliser ces processus.
Solutions : Approches d’optimisation
Développer une procédure fiable pour exprimer des protéines cibles de haute qualité nécessite souvent une optimisation systématique. Il n’existe pas de solution universelle, donc le processus d’expression et de purification doit être soigneusement adapté à chaque protéine.
Hôtes appropriés
Le choix des cellules hôtes détermine les schémas de pliage et de modification post-traductionnelle (PTM) de la protéine recombinante, et doit être soigneusement considéré en fonction des attributs protéiques souhaités.
Vecteurs et conditions de culture
Les vecteurs servent de véhicules pour délivrer les gènes cibles dans les cellules hôtes. Ils incluent généralement des composants essentiels tels qu’un site de clonage multiple (MCS) pour le gène d’intérêt, un promoteur pour driver l’expression, et des gènes de résistance aux antibiotiques pour la sélection. De nombreux vecteurs commerciaux sont pré-optimisés pour une efficacité de transfection et d’expression élevée.
En complément de l’optimisation des vecteurs, les conditions de culture — telles que la durée et la température — doivent être finement ajustées pour préserver l’intégrité de la protéine cible. Des additifs peuvent également améliorer les rendements. Par exemple, l’incorporation d’ions métalliques et de cofacteurs a montré qu’elle stabilise les enzymes pendant l’expression et améliore leur activité.
Constructions protéiques
Certaines caractéristiques structurelles des protéines cibles peuvent déstabiliser l’expression recombinante. Les régions à forte hydrophobicité, à désordre intrinsèque ou à motifs d’acides aminés répétitifs sont souvent en cause. Lorsque ces régions ne sont pas essentielles à la fonction protéique, leur suppression peut considérablement améliorer la stabilité et les niveaux d’expression des protéines.
Procédures de purification
Les protéines sont très sensibles à leur environnement chimique. Des facteurs tels que le pH, la force ionique et les conditions oxydatives peuvent affecter la stabilité et devraient guider le développement des tampons de purification et de stockage. Des additifs peuvent également être nécessaires pour stabiliser les protéines ou améliorer l’exposition des étiquettes d’affinité pendant la purification. L’ajustement de la formule de détergent a amélioré l’extraction des protéines, et un détergent différent (DDM) a été utilisé lors de l’étape finale de polissage pour stabiliser le produit protéique purifié.
L’expertise de CliniSciences couvre l’expression de divers types de protéines — y compris les enzymes, les anticorps, les protéines membranaires, les cytokines et autres protéines difficiles — à travers différents systèmes cellulaires tels que les bactéries, les levures, les cellules mammaliennes et les systèmes acellulaires, garantissant une production réussie pour des projets impliquant des thérapies, des outils de diagnostic ou des matériaux de recherche :
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Options de vecteurs : Utilisez soit un vecteur que vous fournissez, soit un que nous concevons et produisons, garantissant une expression optimale dans le système choisi pour des résultats fiables.
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Production évolutive : De petite à grande échelle, notre plateforme s’adapte à vos besoins de projet, offrant flexibilité et efficacité à chaque étape de production.
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Tests parallèles : Notre plateforme multi-systèmes permet des tests simultanés à travers différents systèmes, nous permettant d’identifier rapidement les meilleures conditions d’expression pour votre protéine.
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Optimisation : Étendez les conditions de production dans un seul système pour affiner et déterminer le meilleur rendement et la meilleure fonctionnalité, garantissant une sortie de la plus haute qualité.