Protocolo de inmunohistoquímica - Método de la avidina/biotina (ABC)
I. Material necesario
Reactivos
- Un anticuerpo primario , marcado o no, contra la molécula diana
- Kit revelación
- Cromógeno
Búferes
- Xileno
- Baños alcohólicos al 70%, 80%y 95%
- Peróxido de hidrógeno (H2O2)
- Tris EDTA, Tris HCl
- Tween-20
Reactivos
- Un anticuerpo primario , marcado o no, contra la molécula diana
- Kit revelación
- Cromógeno
Búferes
- Xileno
- Baños alcohólicos al 70%, 80%y 95%
- Peróxido de hidrógeno (H2O2)
- Tris EDTA, Tris HCl
- Tween-20
II. Tiempo de experimentación
- 10 minpara el bloqueo de la peroxidasa
- 30 min para la recuperación de antígenos (si es necesario)
- 30-60 minpara incubación con anticuerpo primario
- 10 minpara inubación con anticuerpo secundario biotinilado
- 10 minpara incubación con conjugado de estreptvidina peroxidasa
- 5 minpara cromógeno
- 5 minpara cromógeno
- Tinción con hematoxilina (opcional)
- TOTAL : 2-3 horas
- TOTAL : 2-3 horas
III. Protocolo
- Bloqueo de peroxidasa : Aplicar 2 gotas (100 µl) o volumen suficiente de reactivo de bloqueo de peroxidasa (solución al 3%H2O2) para cubrir la sección de tejido e incubar. Enjuagar el portaobjetos con agua destilada
- Pretratamiento HIER (consulte la hoja de especificaciones del anticuerpo) : La Recuperación de Epítopos Inducida por Calor (HIER) puede ser necesaria para el anticuerpo primario sugerido por el proveedor. Lavar con PBS 2 min, 3 veces.
- Pre-bloqueo : Añadir 2 gotas o un volumen suficiente de solución de pre-bloqueo para cubrir completamente la sección de tejido e incubar. Secar la solución, no enjuagar.
- Anticuerpo primario (suministrado por el usuario) : Aplicar 2 gotas o un volumen suficiente de anticuerpo primario para cubrir completamente la sección de tejido. Incubar en cámara húmeda durante 30-60 min.
- Anticuerpo secundario : Aplicar 2 gotas o volumen suficiente de anticuerpo primario para cubrir completamente la sección de tejido. Incubar durante 10 min.
- HRP-estreptavidina : Aplicar 2 gotas o volumen suficiente de HRP-estreptavidina para cubrir completamente la sección de tejido e incubar 10 min. Aclarar con PBS durante 2 min, 3 veces.
-- Cromógeno : Añadir 1 gota o 2 gotas (para mayor sensibilidad y contraste) de concentrado de cromógeno a 1 ml de Substrat. Mezclar bien, proteger de la luz y utilizar antes de 5 horas. Aplicar 2 gotas (100 µl) o volumen suficiente de cromógeno premezclado para cubrir completamente el tejido e incubar 5 minutos. Aclarar con agua destilada durante 2 min, 3 veces.
- Hematoxilina (opcional) : Tinción con 2 gotas (100 µl) o más gotas para cubrir completamente el tejido y esperar unos 10-20 seg. Aclarar bien con agua del grifo durante 1-2 min. Poner los portaobjetos en PBS hasta que muestren color azul (unos 30-60 seg). Aclarar bien con agua destilada.
- Montaje : Siga las instrucciones de montaje de la ficha técnica del fabricante.
Notas :
- La fijación, el grosor del portaobjetos, la recuperación del antígeno, la dilución primaria y el tiempo de incubación afectan significativamente a los resultados. El investigador debe tener en cuenta todos los factores y determinar las condiciones óptimas para interpretar los resultados.
- La tinción de tejidos depende de la manipulación y el procesamiento adecuados de los tejidos antes de la tinción. Una preparación inadecuada de los tejidos puede dar lugar a resultados falsos negativos o a resultados inconsistentes.
- No mezclar reactivos de diferentes lotes.
- No deje que los portaobjetos se sequen en ningún momento durante la tinción.